反相色谱法是以表面非极性载体为固定相，以比固定相极性强的溶剂为流动相的一种液相色谱分离模式．反相色谱固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离．在生物大分子分离中，多采用离子强度较低的酸性水溶液，添加一定量乙腈、异内醇或甲醇等与水互溶的有机溶剂作流动相．普通的反相色谱固定相和孔径大于300Å的硅胶键合烷基固定相应用较为普遍，聚合物基质的反相色谱固定相也有较多应用．
　　反相色谱中样品的保留值主要由固定相比表面积、键合相种类和浓度决定，保留值通常随链长增长或键合相的疏水性增强而增大，对于非极性化合物通常遵循以下规则：(弱)非键合硅胶<<氰基<C1(TMS)<C3<C4<苯基<C8≈C18(强)．溶质保留值与固定相表面积成正比，普通载体(80&Aring;)的表面积约为250m2/g，而300&Aring;孔径载体的比表面积约为60m2/g。当其他条件相同时，溶质在300&Aring;孔径(低表面积)色谱柱上的保留值大约为80&Aring;孔径色谱柱上保留值的1/4(60：250)，小孔隙柱如高保留的C18柱或石墨碳柱有利于强亲水性样品洗脱．样品的保留值也可以通过改变流动相组成或溶剂强度来调整，溶剂强度取决于有机溶剂的性质和其在流动相中的浓度．在反相色谱中，采用高溶剂强度、低极性的流动相时可获得较低保留值．固定相的不同也可以导致选择性发生变化，氰基、苯基、C8、C18等柱的选择性有很大差异，一般应优先考虑C8、C18柱，然后是氰基柱，再次是苯基柱．
　　反相条件下，大多数蛋白质由于低PH、有机溶剂存在、温度高于室温和疏水键合相等综合原因发生变性，这些化合物可能以两种或两种以上独立或动态平衡的形式存在，它们通过色谱柱的保留速度不同，导致谱峰展宽、变形、甚至出现单一蛋白有多个峰的现象，部分变性也易使蛋白在柱上聚集，造成被洗脱蛋白的回收率低和鬼峰．反相色谱固定相表面烷基链长度对蛋白质的反相保留和蛋白质的活性回收有很大差异，烷基链越长(C8、C22、C30)，固定相疏水性越强，为使蛋白质等生物分子洗脱，流动相合机溶剂的含量较高，疏水性过强，会导致生物分子的不可逆吸附和生物活性损失，因此短链烷基固定相(C4、C8、苯基等)在生物大分子分离中表现出优势。对多数小蛋白，在低pH乙腈/水梯度下，用C3~C8色谱柱分离，使蛋白完全展开并避免聚集或沉淀，能够得到理想的分离结果．
　　在低pH流动相条件下进行分离，如(0.1%TFA适合于大多数样品，10~25mmol/L磷酸对疏水性强的蛋白质更有利；以乙腈作有机溶剂，丙醇可能对疏水性强的蛋白质有利；柱温50~80℃；将样品溶于6mol/L尿素或盐酸胍中(只可在室温)进行预处理；用疏水性更强的键合相(长链与短链烷基键合相)；加两性表面活件剂分离大分子和疏水性强的蛋白质等实验条件有利于蛋白质样品完全变性或尽可能降低变性。

　　在分配色谱中，组分在色谱柱上的保留程度，取决于它们在固定相和流动相之间的分配系数，组分在固定相上的保留时间越长，固定相与流动相之间的极性差值越大。而流动相为极性，固定相为非极性的液相色谱就是反相液相色谱。